[음식화학실험] 단백질 정성시험 : Biuret reaction, Ninhydrin reaction, Xanthoprotein reaction 봅시다

I. 목적 단백질 및 아미노산의 구조적 특이성과 원색 반응 사이의 관계를 탐색 시약의 종류에 의해서 나쁘지 않고 나쁘지는 않다 색 확인 및 대조 천연 단백질 시료 사이의 반응 결과 및 차이점 비교 평가 II. 검토 이론 1)단백질 단백질은 생물체의 생명 유지에 가장 중요하고 효소 항체 유전자와 일부 비타민과 호르몬 등의 주요 성분을 이루고 생물체의 생리 기능 유지에 중요한 역할을 하다. 단백질은 20종의 아미노산에서 각각의 DNA에 의해서 그 생물이 생명 활동을 영위하는 데 필요한 각각의 고유 단백질을 만들고 있기 때문에 같은 기능을 하는 경우에도 생물이 다르면 그의 특성도 다른 경우가 많다. 단백질이 탄소, 수소, 산소를 함유하는 것은 당질이 나쁘지 않고 지질과 마챠은카 지이 나쁘지 않고 그 외에도 평균 16퍼센트의 질소와 황을 함유하는 것이다. 특수한 것은 인, 철, 동, 요오드 등을 포함하는 것도 있어 아미노산을 기본 단위로 한다. 단백질의 구조 단백질의 구조는 1차 구조(아미노산 배열 순서), 2차 구조(α 나쁘지 않고는 구조, β 병풍 구조의 형성)이 많아 3차 구조(2차 구조를 형성한 폴리 펩티드 사슬 β 회전 형성)와 4차 구조(3차 구조를 형성한 분자를 서브 유닛으로 복수의 개집합)을 한다. 천연 단백질은 다양한 물리적 혹은 화학적 처리로 쉽게 변성되는데, 이는 고차 구조가 비가역적 또는 가역적으로 파괴되기 때문임 2)아미노산(Amino acid)천연의 단백질을 구성하는 아미노산은 약 20여 종이 있고 proline과 hydroxy proline을 제외하고는 모드 α 위치에 탄소에 아미의 기초를 갖카복실상임. R부분이 수소인 glycine을 제외하고 아미노산은 모드β위치인 탄소가 부정탄소원자(asymmetric carbon)로 되어 있으며 광학이성체가 존재하고 부제탄소원자의 수가 n개이면 개의 이성체가 존재할 것이다. 아미노산의 D형과 L형은 당의 경우와 함께 글리세르알데히드를 기준으로 결정된다. 일반적으로 단백질을 구성하는 아미노산은 L-α-아미노산이다.

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3)아미노산의 종류의 아미노산은 분자 중에 아미노기(-NH2)와 카르복 실기(-COOH)의 수에 의해서 중성 아미노산, 산성 아미노산, 염기성 아미노산 등으로 구분하고, 측쇄(side chain)인 R의 종류에 따라서지방족 아미노산 함황 아미노산, 방향족 아미노산, 환상 아미노산 등으로 구분하는 것이다. 22종의 아미노산 중 단백질을 구성하는 뭔가 아미노산 20종은 글리신, 알라닌, 발린·류신, 이소류신, 트레오닌·세린, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루탐 산·글루타민, 리신, 아르기닌, 히스티 딘·페닐알라닌, 티로신, 트립 토판··린입니다.20종의 그럭저럭 아미노산 중 체내에서 합성이 되지 않고 소식품을 통해서 식사 준비를 할 필수 아미노산은 9종에 발린·류신, 이소류신·메티오닌, 트레오닌, 라이신·페닐알라닌, 트립 토판, 히스티딘입니다. 비필수아미노산은 아미노전이효소에 의해 체내에서 필수아미노산에서 합성할 수 있으며, 글루탐·아스파긴·알라닌·프롤린 등의 비필수아미노산은 보다 쉽게 아미노전이반응이 하나도 나쁘지 않아 다른 비필수아미노산을 합성할 수 있다.​ 4)Peptide bond이분자의 아미노산은 펩티드 결합(peptide bond)로 불리는 축합 아미드 결합(amide linkage)에 의해서 공유 결합을 형성하고 다이 펩티드(dipeptide)이다. 이런 종류의 결합은 아미노산 분자 가 나의 실기란 다른 아미노산 분자의 아미노기에서 H2O을 제거(탈수함으로써 발발된다. 펩타이드 결합의 발발은 축합 반응의 한 예로, 세포에서 하나 나쁘지는 않은 일방적 반응입니다.펩타이드로 결합하지 않은 아미노기를 가지고 있는 측의 펩타이드 사슬의 화단에 있는 아미노산 잔기를 아미노-화단(amino-terminal) 잔기(N-화단잔기)라고 하며, 그 반대측의 화단에 결합되지 않은 카복실기를 가진 잔기를 카복실-화단(carboxyl-terminal) 잔기(C-화단잔기)라고 할 것이다. 보통 폴리펩타이드 나쁘지 않으며 단백질의 아미노산 서열을 표시할 때 아미노-화단의 아미노산은 왼쪽 끝에, 카복실-화단의 아미노산은 오른쪽 끝에 제시된다. 서열도 아미노산에서 시작해 왼쪽에서 오른쪽으로 읽으며 나쁘지 않다. ​ 5)교무욜 원리 ① Biuret reaction:Dipeptide bond이상의 단백질 확인 반응 뷰렛 반응 시약 중에는 2가 구리 이온(Cu2+)이 들어 있기 때문에 푸른색을 띤다. 시약이 단백질과 섞이지 않으면 보라색으로 색이 변하는 성질을 이용해 단백질 검출에 사용한다. 색이 변하는 이유는 펩티드 결합이 두개 이상 존재하는 구조를 뷰렛으로 알려졌으나 이 뷰렛 구조가 2가의 구리 이온과 반응하고 보라 색의 착 화합물을 형성하기 때문입니다. 모든 단백질은 기본적으로 무수한 펩타이드 결합으로 이루어져 있기 때문에 뷰렛 반응으로 검출할 수 있다. 단백질뿐 아니라 단 몇 개의 펩타이드 결합을 가진 펩타이드도 검출할 수 있다. ​ ② Ninhydrin reaction:α-amino acid, peptide, protein확인 반응:닌히드린+아미노산 → 히도라리당티은+RCHO+NH3+co2→ 히도라리당티은 2분자+NH3→ 착색 화합물(보라)+3h2O

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β아미노산의 발색 반응 아미노산 검출 및 정량에 이용된다. 특히 아미노산 자동분석계, 종이 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피에도 많이 사용되고 있다. 닌히드린(ninhydrin)은 일반적으로 아미노기(-NH2)과 반응하기 때문에 요소, 한급 아민, 펩티드와도 반응하지만, 아미노산 α-아미노 기와 잘 반응하고 청자색의 루에멩의 보라 색(Ruhemann's purple)을 촉발하는 것이다. 이 반응은 아미노산, 펩타이드, 단백질 뿐만 아니라 아민, 암모니아 등도 양성을 과도하게 느끼고 매우 민감하기 때문에 정량 및 정성시험에 널리 사용된다. 단백질이 가수분해되어 형성되는 비필수 아미노산인 프롤린이 과린히드록시프롤린은 노란색 색소를 발발한다. 3 Xanthoprotein reaction:Aromatic amino acid(Tyrosine, Trptophan, Phenylalanine)

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단백질의 정성반응의 업무로서 소량의 진한 질산과 가열하면 단백질은 노랗게 된다. 이 원리는 단백질 구성 아미노산의 페놀 또는 퀴논성 벤젠 고리 부분이 산성 하에서 니트로화 되어 발생하는 니트로 화합물이 노란색이 되는 것에 의합니다. III. 재료 및 비결일. 연구재료 연구에 사용된 기구로는 스포이드, 시험관, Waterbath, Labeling tape, 네이더 펜이 사용되었으며 시료로는 우유, 난백, glucose, sucrose, alanine, tryptophan, glutamine, gelatin, D.W가 사용되었다. 연구에 사용된 시약이 40퍼.세인트 NaOH, 일 좋아합니다. 세인트 CuSO4∙ 5H2O일 좋아합니다.세인트 ninhydrin, 진한 HNO3이 사용됐다. 2. 연구의 비결(일)Biuret raection:Dipeptide bond이상의 단백질 확인 반응 시험 관에 시료 용액 2ml과 40퍼.세인트 NaOH용액 2mL을 가합니다.일 좋아합니다.세인트 CuSO4∙ 5H2O용액 일 2방울(2ml 넣고 혼합합니다.처소음에는 붉은색이 되고 여기에 황산동을 넣으면 청자색이 보라색이 된다.분자량이 클수록 청자색, 적을수록 적자색이 된다. ② Ninhydrin reaction:α-amino acid, peptide, protein확인 반응 시료 용액 2ml를 시험관에 먹고 일 좋아합니다.세인트 ninhydrin용액을 일-2방울 첨가합니다.가열하면 청자색 반응이 나타난다.***proline은 노란색, hydroxyproline은 등황색을 나타낸다.가열 시에는 단백질 응고에 유의합니다. ③ Xanthoprotein reaction:Aromatic amino acid(Tyrosine, Tryptophan, Phenyl alanine)시료엑 3ml에 짙은 HNO3일 ml를 더하면 백색 침전이 발생된다.가열하면 침전이 용해되어 황색반응이 나타난다.냉각 후 짙은 NaOH(혹은 짙은 NH4OH용액 일 2방울을 넣어 알칼리성이면 오렌지 색의 반응이 나타난다. IV. 연구 결과

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점검 결과 단백질이 아닌 glucose, sucrose, D.W는 어떤 시약에도 반응이 자신 있지 않았으며 우유와 난백은 세 가지 반응에서 모드 양성으로 확인됐다. 각각의 반응을 보면 Biuretreaction에 의해 우유, 난백, gelatin의 짙은 청자색이 확인되었다. Ninhydrin reaction에 따라 우유, 난백, alanine, tryptophan, glutamine, gelatin의 반응이 양성이라고 자신했다. 방향족 아미노산을 확인할 수 있는 Xanthoprote in reaction을 통해 우유와 난백, tryptophan의 양성반응이 확인되었으며, 특히 tryptophan의 경우 NaOH를 넣으면 거품을 형성하여 선명한 오렌지색이 발발하였으나 우유와 난백의 경우 비교적 옅은 오렌지색이 발발하였다. Ⅴ.고찰 우유는 약 3%의 단백질을 함유하고 있다. 우유 단백질의 주성분은 인 단백질의 카제인이고, 우유의 유청에는 락토알부민과 락토글로불린이 존재합니다. 난백의 주된 단백질 성분은 오브알부민으로 그 밖에 라이소자입니다, 아비딘, 오범신, 오범코이드 등 다양한 단백질이 함유되어 있다. 알부민과 글로불린은 α-아미노산으로만 이루어진 단순 단백질로, 가용성 단백질과 불용성 단백질로 크게 나뉜다. 이런 단백질이 난백과 우유에 들어 있기 때문에 뷔렛 반응과 닌하이드린 반응에 양성이 된다.Biuretreaction 뷰렛 반응을 통해 우유, 달걀 흰자, gelatin이 다른 시료에 비해 진한 보라색으로 확인되었다. gelatin은 1차 유도 단백질로 콜라겐을 물에 장시간 끓여 변형된 단백질입니다. 구조식을 보면 단순 단백질에 비해 복잡한 구조를 하고 있으며 dipeptide 결합 이상의 다양한 ヘ타이드 결합이 이루어지고 있음을 확인할 수 있다. alanine, tryptophan, glutamine의 경우 펩타이드 결합이 없는 아미노산 구조에서 뷰렛 반응에 반응하지 않는다.

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Ninhydrinreaction Ninhydrinreaction에 따라 우유, 난백, alanine, tryptophan, glutamine, gelatin의 반응이 양성으로 밝혀졌다. alanine의 경우 Ninhydrin reaction에서만 양성이라고 시인했다. Ninhydrin reaction은 α-아미노기와 잘 반응할 것이다. α-아미노기는 carboxyl group 근처에 있는 탄소원자에 amino group이 붙어 있는 화합물이었다. 일반적으로 발견되는 20의 아미노산은 모두 α-amino였다. 그 때문에 alanine, tryptophan, glutamine이라는 반응을 보였다. 역시 gelatin의 역시 α-아미노산과 peptide 결합을 가지고 있어 청자색의 정색반응이 우수했다. Xanthoprote in reaction tryptophan 구조상 뚜렷한 벤젠 고리를 가지고 있었으며 NaOH를 넣었을 때 분명한 오렌지색 반응을 확인할 수 있었다. 우유와 흰자의 경우 오렌지색이 아닌 연한 노란색 침전물을 확인할 수 있었다. 그 이유는 방향족 아미노산이 적은 양을 함유하고 있으며 트립토판에 비해 비교적 담색과 약한 반응을 보였다. VI. 실험요약본 실험은 단백질 및 아미노산의 구조적 특이성과 진색반응의 관계를 탐색하고 시약의 종류에 따라 자신이 원하는 색을 확인하고 비교해 보는 실험이었다. 역시 천연 단백질 시료 간의 반응 결과와의 차이를 비교 평가하여 단백질의 성질을 이해할 수 있다. 본 실험에서는 뷰렛 반응, Ninhydrin 반응, Xanthoprotein 반응을 진행했다. 뷰렛 반응은 dipeptidebond 이상의 단백질 확인이 가능한 실험으로 우유, 난백, gelatin의 정색 반응이 양성으로 사료되었다. Ninhydrinreaction은 α-amino기, 펩타이드, 단백질 확인반응에서 우유, 난백, alanine, tryptophan, glutamine, gelatin이 양성으로 나타났다. 마지막으로 방향족 아미노산을 확인할 수 있는 Xanthoprotein 반응을 이용하여 우유와 난백, tryptophan의 양성 반응을 확인할 수 있었다. Ⅶ.참고 문헌" 맛있는 음식 화학 실험 프린트", 표용히 교수"이해하기 쉬운 맛있는 음식 화학", 20하나 5.2.28. 송테히 ∙ 유 정희, 도서 출판 효일"두산 백과""영양학 사전"하나 998.3. 하나 5. 최 봄속 ∙ 김 울산" 맛있는 음식 과학 기술 대 사전", 2008.4. 하나 0. 여자 문화사"생화학 백과", 생화학 분자 생물학회